В грамоте о восшествии на престол самозванец лгал, будто бы Патриарх Иов присягнул ему, но, не добившись через своих клевретов присяги от Святейшего, решил свести Патриарха Иова с Московского престола. Изнемогавший под бременем трудов и болезней старец-Патриарх, как обычно, в молитве искал отрады и успокоения.

Через несколько дней после гибели царя Теодора Борисовича от рук мятежников вооруженная толпа ворвалась в алтарь Успенского собора Кремля, где Патриарх Иов совершал Божественную литургию. Не дав окончить священнодействия, они сорвали со святителя священные одежды.

Патриарх властно отстранил злодеев, подошел к Владимирской чудотворной иконе Божьей Матери, снял с себя драгоценную панагию, подаренную царем Теодором Иоанновичем и возложенную на него Вселенским Патриархом при интронизации на Московское патриаршество, положил сей великий дар у иконы и сказал вслух всем: "Здесь, в этом храме, пред сею иконою святою я удостоен был сана архиерейского и девятнадцать лет хранил целость веры; ныне вижу бедствие Церкви, торжество ереси. Матерь Божья, спаси Православие!"

Бунтовщики не вняли его словам и молитве; они волокли старца по храму, глумливо смеялись над ним и наконец потащили к Лобному месту. Беснующаяся толпа с криками "Богат, богат, богат Иов Патриарх, идем и разграбим его!" бросилась в патриаршие палаты и ризницу. Измученного старца посадили на телегу и отвезли в Старицкий Успенский монастырь.

Так под конец своего земного странствия Патриарх Иов вернулся в мирную обитель своей юности. Блаженного старца принял верный его духовный сын архимандрит Дионисий, настоятель монастыря; он постарался дать полный покой мужественному исповеднику Православия. Игумен Дионисий впоследствии стал настоятелем Троице-Сергиева монастыря и руководил обороной обители во время осады ее поляками.

Многомесячное стояние у Лавры сотни чернецов против самозванцев было началом освобождения России от смуты. Преподобный Дионисий Радонежский воспринял от Святейшего Иова дух защиты Православия и Отечества, вдохновил своих монахов и через победу над смутой передал сей дух потомкам. В эпоху всеобщего соблазна только святитель Иов остался непреклонен и верен прежним обетам и целованиям святого Креста Господня. Эту верность он передал преподобному Дионисию, а затем и Гермогену, Патриарху-священномученику.

Мятежники захотели поставить на якобы вдовствующий патриарший престол архиепископа Рязанского Игнатия. Он отправился в Старицу для получения благословения от святителя Иова на патриаршее восшествие.

Несмотря на угрозы, святитель решительно отказался благословить изменника Церкви и Отечества и только сказал: "По ватаге атаман, а по овцам и пастырь".После низвержения Лжедмитрия святители, собравшиеся в Москве по случаю коронования Василия Шуйского, просили Патриарха Иова возвратиться на свой престол. Но старец к тому времени ослеп и, как свидетельствует предание, благословил на место свое митрополита Казанского Гермогена.Воцарение Шуйского не умиротворило Русь; польские козни, народные волнения и самозванство усугубились боярскими распрями.Патриарх Гермоген и царь Василий решили дать народу возможность покаяться, очиститься от скверны лжи и нарушения крестного целования, а для прощения и разрешения этих грехов умолить старца-Патриарха Иова прийти в Москву и принять всенародное покаяние.За старцем были отправлены митрополиты Крутицкий Пафнутий, Симоновский архимандрит Пимен, патриарший архидиакон и государев дьяк.Патриарх Гермоген писал Иову: "Государю отцу нашему, Святейшему Иову Патриарху, сын твой и богомолец Гермоген, Патриарх Московский, челом бью... Мы сильно желаем видеть тебя, и сподобиться благословения десницы твоей, особенно же молим сотворить о нас молитву к Богу, да даст милосердный Господь, ради святых молитв твоих, Российскому государству мир, покой и тишину, а святым церквам и христианской вере твердость".Старец-Патриарх прибыл в Москву 14 февраля, и после торжественного совещания обоих Патриархов с духовенством было указано народу собраться в Успенский собор. В назначенный день 20 февраля весь Кремль был наполнен народом; Святейший Патриарх Иов пришел в собор в рясе простого монаха, плача и рыдая, облобызал соборные святыни — чудотворные иконы и мощи первосвятителей Московских и встал у патриаршего места.