Через полгода, 2 апреля 1840 года, его зачислили в число братии монастыря и одели в подрясник. Первое время послушник Александр был келейником и чтецом у преподобного старца Льва, затем работал в хлебне, варил хмелины (дрожжи), пек булки. Но недолго ему пришлось пожить в монастыре: в ноябре 1840 года его перевели в скит помощником повара, где он и трудился в течение года. Работа отнимала большую часть дня, и ему мало приходилось бывать на богослужениях, что и приучало его к внутренней непрестанной молитве.

Преподобный старец Лев перед своею кончиною, передавая послушника Александра преподобному старцу Макарию, сказал: «Вот человек больно ютится к нам, старцам. Я теперь уже очень слаб. Так вот я и передаю тебе его из полы в полу, владей им, как знаешь».

С осени 1841 года по 2 января 1846 года послушник Александр был келейником у преподобного Макария. К старцу приходилось ему по послушанию ходить каждый день, и он имел возможность советоваться с батюшкой по многим вопросам, поэтому его жизнь протекала внешне спокойно, и если были искушения, то благодаря исповеди и мудрым советам старца легко побеждались, а на душе восстанавливались мир и спокойствие.

Летом 1841 года послушник Александр был пострижен в рясофор, а 29 ноября 1842 года его постригли в мантию и нарекли Амвросием в честь святого Амвросия, епископа Медиоланского. 4 февраля 1843 года монаха Амвросия рукоположили во иеродиакона, а 9 декабря 1845 года епископом Николаем Калужским он был рукоположен во иеромонаха. Началось служение отца Амвросия у престола, которое всегда сопровождалось чувством глубокого благоговения.

Недолго ему суждено было приносить Господу Безкровную Жертву. Во время поездки в Калугу для рукоположения он сильно простудился и стал чувствовать постоянное недомогание. По временам он бывал так слаб, что во время Божественной литургии, когда причащал богомольцев, не мог держать потир в руке и, чтобы немного прийти в себя, возвращался на время в алтарь.

В декабре 1847 года иеромонах Амвросий был вынужден по состоянию здоровья выйти за штат, будучи признан неспособным к послушанию, и стал числиться на иждивении обители. С тех пор он не мог совершать Литургии, так как был очень слаб. Лечение не помогало, болезнь затягивалась. Вероятно, в это время он был келейно пострижен в схиму с сохранением имени Амвросия. Но тяжелая и продолжительная болезнь была явным действием Промысла Божия: ему открывался путь духовничества и старчества. Еще при жизни преподобного Макария, с благословения старца, некоторые из братии приходили к отцу Амвросию для откровения помыслов. Так старец Макарий постепенно готовил себе достойного преемника.

После кончины преподобного Макария 7 сентября 1860 года отец Амвросий переселился в домик вблизи скитской ограды, справа от колокольни. На западной стороне его была сделана пристройка, называемая «хибаркой», сюда к старцу за советом приходили женщины: в скит их не пускали. Более тридцати лет прожил здесь преподобный Амвросий, самоотверженно служа ближним.

Повседневная жизнь преподобного Амвросия начиналась с келейного правила. Он вставал в четыре часа утра, приходили келейники и прочитывали утренние молитвы, двенадцать избранных псалмов и первый час. После непродолжительного отдыха старец слушал часы: третий, шестой с изобразительными и, смотря по дню, канон с акафистом Спасителю или Божией Матери, которые он выслушивал стоя. Вечернее молитвенное правило состояло из малого повечерия, канона Ангелу-хранителю и вечерних молитв.

Целый день дверь его кельи была открыта, и сотни людей шли к нему со своими нуждами и немощами, чтобы получить духовное утешение, разрешение житейских вопросов, вразумление, прощение грехов. К нему приезжали известные общественные деятели и писатели: Ф. М. Достоевский, В. С. Соловьев, К. Н. Леонтьев, Л. Н. Толстой, М. Н. Погодин, Н. Н. Страхов и другие. Старец принимал всех с одинаковой любовью и благорасположением. Чем же так привлекал к себе сердца людей преподобный Амвросий? На нем очевидно для всех почивала благодать Божия. Преподобный Амвросий стяжал дары Святаго Духа: старческую рассудительность, евангельскую любовь, прозорливость, дар исцелений. Но все свои дарования преподобный Амвросий скрывал — смирением. Он никогда не учил прямо от себя, но свое поучение основывал на словах Священного Писания или говорил сокровенно, скрывая свое знание за словами: люди говорят. Дар исцеления старец скрывал, посылая больных к известным чудотворным источникам или святыням. Дар смирения позволил преподобному скрыть свою внутреннюю духовную жизнь, несмотря на то, что почти все время он был на людях. Познав на личном опыте спасительность смирения, старец стремился научить этому и своих духовных детей. На самый насущный вопрос для каждого человека: «Как жить, чтобы спастись?» — преподобный давал такие ответы: «Нужно жить нелицемерно и вести себя примерно, тогда дело наше будет верно, а иначе будет скверно», или «Жить можно и в миру, только не на юру, а жить тихо», или «Жить — не тужить, никого не осуждать, никому не досаждать, и всем мое почтение». Так в шутливом виде он передавал людям крупицы духовной мудрости и служил миру, ущедренный от Бога дарованиями благодати Божией и проникнутый любовью к страждущим людям.

Несмотря на множество посетителей и постоянное свое недомогание, старец Амвросий оказывал посильную помощь преподобному Макарию в книгоиздательстве. Но если при преподобном Макарии издавалась только святоотеческая аскетическая литература, то при старце Амвросии стали печататься еще и церковно-исторические труды Оптиной Пустыни.

Кроме того, были выпущены 20 брошюр разного содержания и новые издания вышедших ранее книг. Особое внимание уделялось жизнеописаниям и творениям оптинских старцев и святых отцов. Изданные книги рассылались по библиотекам монастырей, академиям, семинариям, епархиальным архиереям и раздавались богомольцам. Оценивая издательскую деятельность Оптиной Пустыни, святитель Игнатий (Брянчанинов) писал: «Все русское монашество обязано особенною благодарностью Оптиной Пустыни за издание многих творений святых отцов...»

Литературноиздательской деятельностью, окормлением насельников и богомольцев Оптиной Пустыни, огромной перепиской по самым разным вопросам не исчерпывались многообразные труды преподобного старца Амвросия. С его именем связано устройство Шамординской женской обители.

В 1884 году недалеко от Оптиной Пустыни в деревне Шамордино, по благословению старца Амвросия, была устроена женская община, в которую, в отличие от других монастырей, принимали неимущих и больных женщин. Заботами, трудами и молитвами старца Амвросия обитель постоянно росла. Для непосредственного наблюдения за хозяйством преподобный Амвросий приезжал в Шамордино ежегодно. Много внимания уделял старец общине: духовным беседам с сестрами и настоятельницей. Именно здесь суждено было преподобному Амвросию встретить свою кончину.

2 июня 1890 года он, по обыкновению, выехал в Шамординскую обитель на лето. Старец посетил постройки в Руднево, беседовал с настоятельницей о насущных делах, принимал сестер. Пробыв более двух недель, он стал собираться обратно в Оптину. Был назначен и день отъезда, но батюшка почувствовал такую слабость, что не смог покинуть обитель. Он три раза пытался вернуться в Оптину, но по причине своего нездоровья задержался здесь более чем на год.