і I

5' — Г А А Т Т Ц — 3' 5' — Г |__АА_Т Т Ц — 3'

З' — ЦТТААГ — 5,=> 3' — ЦТ Т А А | Г — 5'

В результате ступенчатого разреза образуются фрагменты ДНК с выступающими однонитевыми концами, комплементарными друг другу. Эти концы могут вновь соединяться, поэтому их называют «липкими концами». Если взять ДНК, например, человека и моркови, обработать одной и той же рестриктазой и смешать, то фрагменты ДНК моркови и человека будут соединяться липкими концами. Но такая связь будет непрочной: водородные связи между всего лишь четырьмя парами оснований могут легко разойтись. Слипшиеся фрагменты ДНК можно зафиксировать, если добавить в раствор ДНК-лигазу (второй по значимости фермент ГИ), сшивающую цепи ДНК, разрезанные рестриктазой. В результате получится стабильная рекомбинантная ДНК.

Встраивание рекомбинантной ДНК в вектор

Далее необходимо сохранить и размножить полученные рекомбинантные молекулы. С этой целью их встраивают в специальные конструкции, называемые векторными молекулами ДНК, или векторами. Обычно векторы конструируют из бактериальных плазмид. Типичный вектор включает:

А А Т Т

I I

ДНК

Сайт узнавания рестриктазой

1. Сайт узнавания определенной рестриктазой для встраивания в вектор целевой ДНК.

2. Ген устойчивости к одному из антибиотиков для последующего отбора клеток, получивших рекомбинантный вектор.

3. Особую последовательность нуклеотидов ДНК, обеспечивающую репликацию вектора в клетках кишечной палочки, независимую (автономную) от репликации хромосомной ДНК.

Приведем пример использования вектора для получения

штамма кишечной палочки, продуцирующей целевой белок. Для встраивания в вектор смесь фрагментов целевой ДНК (с геном, кодирующим целевой белок) и ДНК вектора обрабатывают сначала одной и той же рестриктазой, затем ДНК-лигазой. В результате образуется рекомбинантный вектор. Для размножения его вводят в клетки кишечной палочки или дрожжей. На поверхности твердой питательной среды с антибиотиком каждая клетка, несущая рекомбинантный вектор, размножается и образует колонию из одинаковых клеток — клон. Каждая клетка-родоначальница клона получила одну молекулу рекомбинантного вектора, которая реплицируется и передается всем клеткам колонии. Поэтому такую процедуру называют молекулярным клонированием.

Рекомби