Во время пребывания иеромонаха Софрония по архиерейским делам в Петербурге, на него обратили особое внимание в Синоде. Когда возникла необходимость пополнить братство Александро-Невского монастыря в Санкт-Петербурге, то в числе 29 иноков, вызванных из разных монастырей России, в январе 1742 года был вызван и будущий святитель. Год спустя его назначили казначеем монастыря, а в 1746 году он был утвержден в должности наместника обители, которую исполнял более семи лет.

В помощь себе святой иеромонах Софроний вызвал своего земляка, уроженца города Прилуки, иеромонаха Синесия и поставил его строителем Ново-Сергиевой пустыни, приписанной к Александро-Невскому монастырю. С того времени дружба двух подвижников — иеромонаха Софрония и иеромонаха Синесия — все более крепла в едином пастырском делании, они уже были неразлучны вплоть до своей кончины на Сибирской земле. В эти годы святой Софроний много трудов положил на благоустройство обители и по улучшению преподавания в находившейся при ней семинарии. Совместно с архиепископом Феодосием он заботился о должном укомплектовании монастырской библиотеки.

При нем была построена двухэтажная церковь: верхняя, во имя святого Феодора Ярославича, старшего брата Александра Невского, и нижняя, во имя святителя Иоанна Златоуста.

В 1747 году скончался Иркутский епископ Иннокентий (Нерунович). Шесть лет самая большая по территории Иркутская епархия оставалась без духовного окормления.

Наконец, императрица Елизавета Петровна (1741–1761) указом от 23 февраля 1753 года рекомендовала Святейшему Синоду благочестивого наместника Александро-Невского монастыря святого Софрония, как «лицо, не только достойное епископского сана, но и вполне могущее оправдать желание и надежды государыни и Синода — подъять бремя епископского служения на далекой окраине и удовлетворить нужды паствы в суровой стране, среди дикой природы и произвола людского».

18 апреля 1753 года, в неделю о Фоме, в большом Успенском соборе Московского Кремля святой Софроний был рукоположен во епископа Иркутского и Нерчинского. В Москве большие услуги святителю оказал архиепископ Московский и Севский Платон (Малиновский), который участвовал в его хиротонии. Он преподал ему отеческие наставления на предстоящий подвиг, так как был хорошо знаком с особенностями сибирского духовного быта, предупреждал о своеволии местных властей и советовал подобрать надежных помощников.

Предвидя трудное служение в отдаленном Сибирском крае, новопоставленный святитель не отправился сразу в Иркутскую епархию, но начал подбирать образованных и духовно опытных сотрудников. Святитель Софроний посетил свою первую Красногорскую обитель, был и у святынь Киева, где испрашивал благословение на свое служение у Киево-Печерских угодников.

20 марта 1754 года святитель прибыл в Иркутск. Вначале он заехал в Вознесенский монастырь — место жительства своих предшественников, молился на могиле святителя Иннокентия (Кульчицкого, † 1731; память 26 ноября/9 декабря). Ко времени приезда святителя Софрония иркутские обители уже имели почти столетнюю историю. Основатели этих монастырей были исполнены горячим желанием иноческого, подвижнического жития.

Ознакомившись с положением дел в епархии, святитель Софроний приступил к преобразованиям в Духовной консистории, монастырях и приходах, обратился в Святейший Синод с просьбой прислать достойных людей для священнослужения в Иркутской епархии. Проницательный святитель назначал настоятелями монастырей людей благочестивых, мудрых, деятельных, с большим жизненным и духовным опытом. В 1754 году святитель Софроний возвел своего друга и сподвижника иеромонаха Синесия в архимандрита Вознесенского монастыря. Этот достопамятный настоятель послужил монастырю 33 года до своей кончины. В сентябре 1754 года святитель издал указ, в котором выражалась озабоченность обучением и воспитанием детей. Духовенству вменялось в обязанность обучение своих детей Часослову, Псалтири, пению и букварю, причем учение «должно было идти со всяким прилежанием и крайним рачением, дабы дети могли пономарскую и дьячковскую обязанность исполнять по достоинствам своим».

В проповедях и личных беседах святитель Софроний неустанно побуждал всех к более высоким нравственным идеалам. Большое внимание он уделял благоговейному и правильному совершению богослужения и таинств священнослужителями, а также следил за нравственной чистотой мирян, заботился о положении женщин в семье, охранял их от несправедливостей. Святитель Софроний старался повсеместно водворить уставное богослужение, для чего вызывал к себе священников, диаконов, дьячков и пономарей, которые сослужили во время архиерейского богослужения, участвовали в хоре или иподиаконствовали. Особыми указами он восстановил правильное каждение и благовест.

Призванный на апостольское служение в Сибири, святитель Софроний положил много трудов на просвещение язычников.

С этой целью он заботился об устройстве быта малых народов, способствовал развитию в местном населении оседлости и культуры, предлагал им для поселения монастырские земли и всячески старался изолировать от влияния язычества. К святителю постоянно приходили и приезжали из далеких мест за благословением многочисленные посетители.

Но среди многих забот он не забывал о вечности, о своей внутренней духовной жизни. Сохранилось свидетельство келейника святителя Софрония, который сообщает, что святитель «пищу употреблял самую простую и в малом количестве, служил весьма часто, большую часть ночи проводил в молитве, спал на полу».

Его подвижнический дух соответствовал общему подъему христианского духа в России вследствие подвижнических трудов святителей Феодосия, архиепископа Черниговского († 1696; память 5/18 февраля), Димитрия, митрополита Ростовского († 1709; память 28 октября/10 ноября), Иннокентия, епископа Иркутского († 1711; память 9/22 февраля).