Московский престол по завещанью царя Теодора переходил к его супруге Ирине, но она восхотела принять монашеский постриг. Патриарх стал просить царицу Ирину, чтобы она благословила на царство своего брата Бориса. Несколько дней Патриарх убеждал Бориса — и все тщетно.

На мясопустной неделе 17 февраля 1598 года открылся земский собор речью Патриарха Иова. Поведав о неудачных попытках склонить боярина Бориса Годунова на принятие всероссийского царства, Московский первосвятитель завершил речь свою словами: "Что касается до меня и земского собора, бояр и дворян и православных христиан, которые были в Москве, то наша единодушная мысль та, чтобы, кроме государя Бориса Теодоровича, не искать иного государя". Тогда все выборные земли Русской объявили свое полное согласие с этим мнением.

Но Борис Годунов был непреклонен и не желал принять решения земского собора. Тогда Патриарх устроил крестный ход к стенам Новодевичьего монастыря с чудотворными богородичными иконами: Владимирской, Донской и Петровской.

Борис, увидя крестный ход, сам вышел ему навстречу со Смоленской иконою Божьей Матери. Благословив Бориса крестом, Святейший Патриарх Иов сказал: "Не печалься, Богом избранный сын. Не я совершил сей подвиг, но Пречистая Богородица, возлюбив тебя, пришла к тебе. Устыдись пришествия Ее, не противься Божественной воле и ослушанием не привлеки на себя праведного гнева Его".

Затем Патриарх Иов совершил Божественную литургию в монастыре, после чего благословил избранного на царство Бориса Теодоровича крестом Животворящего древа, нарек царем и провозгласил первое многолетие. Патриарх составил утвердительную грамоту об избрании Бориса Годунова на царство, которую подписали все, числом около пятисот, участники земского собора. По Руси были разосланы грамоты Патриарха, сообщавшие об избрании нового царя и повелевавшие молиться о нем.

Вскоре новая кара обрушилась на Русь — самозванство. Патриарх Иов разослал обличительные грамоты в Малороссию. В соборной грамоте к литовским панам и киевскому воеводе Константину Острожскому велено было поймать самозванца Григория Отрепьева и прислать в Москву для наказания. Все было безуспешно, и к концу 1604 года почти вся Юго-Западная Русь отделилась от Москвы, оказавшись под властью самозванца. Патриарх не переставал писать грамоты и рассылать их по всем землям, призывая помнить Бога и крестное целование царю Борису; в этих посланиях Патриарх Иов клятвенно утверждал, что самозванец есть расстрига Гришка, а не царевич Димитрий. Народ же словно ослеп и оглох, и тогда Патриарх предал анафеме самозванца со всеми его сообщниками как злодея и еретика, замышляющего упразднить Православие на Руси. По повеленью Патриарха анафему произносили во всех церквах великой России.

В апреле 1605 года неожиданно скончался царь Борис, и благодаря стараниям Всероссийского первосвятителя Москва и войско присягнули сыну Борисову — царевичу Теодору. Клятва оказалась некрепкой, спустя сорок дней последовала измена — первого июня на Красной площади был зачитан манифест самозванца. Патриарх умолял бояр успокоить народ, но они устранились от активных действий. Мятежники ворвались в Кремль, зверски расправились с царем Теодором Борисовичем и его матерью и присягнули самозванцу, называя его царем Димитрием. Святейший Патриарх Иов, искренний защитник Отечества и Православия, не тронутый мятежниками, оказался в плену врагов Христовых.

В грамоте о восшествии на престол самозванец лгал, будто бы Патриарх Иов присягнул ему, но, не добившись через своих клевретов присяги от Святейшего, решил свести Патриарха Иова с Московского престола. Изнемогавший под бременем трудов и болезней старец-Патриарх, как обычно, в молитве искал отрады и успокоения.

Через несколько дней после гибели царя Теодора Борисовича от рук мятежников вооруженная толпа ворвалась в алтарь Успенского собора Кремля, где Патриарх Иов совершал Божественную литургию. Не дав окончить священнодействия, они сорвали со святителя священные одежды.

Патриарх властно отстранил злодеев, подошел к Владимирской чудотворной иконе Божьей Матери, снял с себя драгоценную панагию, подаренную царем Теодором Иоанновичем и возложенную на него Вселенским Патриархом при интронизации на Московское патриаршество, положил сей великий дар у иконы и сказал вслух всем: "Здесь, в этом храме, пред сею иконою святою я удостоен был сана архиерейского и девятнадцать лет хранил целость веры; ныне вижу бедствие Церкви, торжество ереси. Матерь Божья, спаси Православие!"

Бунтовщики не вняли его словам и молитве; они волокли старца по храму, глумливо смеялись над ним и наконец потащили к Лобному месту. Беснующаяся толпа с криками "Богат, богат, богат Иов Патриарх, идем и разграбим его!" бросилась в патриаршие палаты и ризницу. Измученного старца посадили на телегу и отвезли в Старицкий Успенский монастырь.

Так под конец своего земного странствия Патриарх Иов вернулся в мирную обитель своей юности. Блаженного старца принял верный его духовный сын архимандрит Дионисий, настоятель монастыря; он постарался дать полный покой мужественному исповеднику Православия. Игумен Дионисий впоследствии стал настоятелем Троице-Сергиева монастыря и руководил обороной обители во время осады ее поляками.

Многомесячное стояние у Лавры сотни чернецов против самозванцев было началом освобождения России от смуты. Преподобный Дионисий Радонежский воспринял от Святейшего Иова дух защиты Православия и Отечества, вдохновил своих монахов и через победу над смутой передал сей дух потомкам. В эпоху всеобщего соблазна только святитель Иов остался непреклонен и верен прежним обетам и целованиям святого Креста Господня. Эту верность он передал преподобному Дионисию, а затем и Гермогену, Патриарху-священномученику.

Мятежники захотели поставить на якобы вдовствующий патриарший престол архиепископа Рязанского Игнатия. Он отправился в Старицу для получения благословения от святителя Иова на патриаршее восшествие.